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全外顯子捕獲那些事兒(上篇)

全外顯子測序(Whole Exome Sequencing,WES)僅對人基因組約2%的區域測序,便可覆蓋絕大多數基因的編碼序列和>99%(臨床基因組資源庫,ClinGen)疾病相關區域。借助WES,可檢測基因的點突變、小片段插入缺失、基因重排及拷貝數變異等信息,隨著測序成本的下降,其在基礎研究、遺傳病篩查、腫瘤分子診斷、免疫治療等領域得到越來越廣泛地應用。


WES測序包含三個部分(圖1):

1)文庫構建;

2)外顯子靶向捕獲;

3)測序分析



圖1. 全外顯子測序流程需要注意的事項。


常見的NGS for Illumina??文庫構建為兩種類型:1)基于A突起的片段分子與T突起的Y型接頭連接構成文庫分子;2)轉座酶快速打斷同時引入接頭序列構成文庫分子。前者因為無偏好性相對更受歡迎。盡管DNA文庫構建試劑盒和各家的靶向捕獲方案不斷完善優化,前期文庫構建和中間的靶向捕獲步驟中仍有不少潛在“雷點”需要考慮,才可能獲得穩定可靠的WES測序數據。


捕獲前文庫構建

起始樣本:老生常談

樣本起始量與質量,是靶向測序分析的基石。尤其是對于低頻突變的準確檢測,足夠的原始拷貝數是先決條件。理論上,在1 ng的人類基因組DNA中,每個基因約有300個原始拷貝。當文庫轉化率為100%時,NGS檢測下限可低至1%(95%置信區間)[1]。雖然多個品牌的試劑盒都支持對低至1 ng DNA樣本起始量建庫,但在建庫的多個步驟存在不同程度的樣本損失,因此難以達到理論的檢測敏感度。這時,就需要我們在最開始時,保證樣本質量并提高起始量。


縱觀目前提供WES測序服務的各家公司,基本上都明確注明“高質量的DNA樣本≥1 μg”。為保證足夠的樣本文庫分子進入全外顯子捕獲測序分析,我們推薦參考表1,并根據實際的樣本情況來確定起始量。

表1. 全外顯子靶向測序樣本要求



另一方面,低質量樣本,如FFPE,則需要特別的處理。FFPE樣本由于在制作過程中可能人為的引入突變,如胞嘧啶經脫氨基轉變為尿嘧啶,形成“C>T”人為突變。因此,對于FFPE樣本在建庫前我們另外建議使用NEBNext??FFPE DNA Repair Mix等專業的修復試劑進行處理,藉此提高文庫產量,降低人為引入的突變[2]。更多FFPE樣本的建議(詳情請參考《FFPE那些事兒》)。



圖2. 在10樣本外顯子混合雜交捕獲,采取“片段雙選”模式進行片段篩選,測序數據的產出。


樣本標簽:小小變化保平安

為了方便后續的文庫擴增和測序,需要對片段化的DNA加上適配測序的接頭。


多個樣本連接上不同序列接頭批量構建文庫,隨后多個樣本文庫混合進入單次捕獲實驗,再之后與其他文庫同時進行測序——這種“高通量”的生產模式你是不是很熟悉?這個模式雖然高效、高性價比,卻有“雷區”。


如圖2,IDT公司相關研究數據顯示,樣本為250 ng片段化gDNA,利用xGen???AML Panel在1-plex、4-plex、8-plex和16-plex混雜水平進行靶向捕獲測序,混雜水平越高,標簽錯配的發生概率越高[3]



圖2. 混合捕獲中,標簽錯配的發生概率隨著混雜水平的提高而升高。

WES常見數據產出為 10 G(以?xGen???Exome Research Panel為例,10 G有效下機數據,其中靶率為約為90%,平均測序深度為130x左右)。WES通常在Illumina???HiSeq X或NovaSeq這類超高通量的測序平臺進行,而這兩種儀器均采用排他性擴增(Exclusion amplification)和Patterned flow cell技術,是易發生標簽跳躍(Index hopping)的“重點機型” (詳情請參考《NGS懸案| 樣本先生,您戴錯帽子了》)。


在整個建庫和捕獲過程中,多個步驟都可能引入標簽錯配,我們在表2中做了相關總結。而接頭上小小的變化——在接頭上引入雙端唯一樣本標簽,便可以從最終下機的數據進行質控。通過P5和P7端獨特的Index雙側校驗剔除標簽錯配,是目前最優的解決方案。


表2.?UDI接頭可以有效改善各個階段發生的標簽錯配


NanoPrepTM??UDI精選多種UDI接頭。其在Index設計過程中,充分考慮了堿基平衡和色彩平衡,并且通過了測序驗證。從設計和功能上,這類UDI接頭都是樣本的“護身符”,保證測序數據的正確分配。隨著多個測序平臺對雙端Index測序模式的開放,高質量的UDI接頭漸漸將成為成行業標配。

接頭濃度:對“癥”下“藥”,有的放矢

在接頭連接步驟,我們推薦根據不同的Input DNA及其片段大小確定接頭用量。不同品牌的文庫均有相應的推薦。


特別值得注意的是,針對外顯子捕獲的文庫構建推薦DNA樣本片段化范圍為150~350 bp。常見接頭濃度為 15 μM。當Input DNA≥500 ng時,適度增加接頭用量可以提高文庫產出量,當Input DNA≤25 ng,接頭應稀釋后使用。以NanoPrep DNA文庫構建系列為例,其推薦接頭稀釋方法如表3。

表3. NanoPrep DNA文庫構建體系推薦接頭使用量



片段雙選:穩定的數據產出量

放入同樣數量的文庫進入捕獲環節,下機數據量卻大相徑庭。你有沒有遇到這種苦惱?尤其是不同類型的樣本,如果不對片段化方式進行調整和優化,有時候文庫出庫產量看起來一樣,其中的分子數目相差甚遠。


在文庫構建流程中,接頭連接后常見一個磁珠純化步驟用于接頭過濾(過濾不完全,游離的接頭也是樣本串擾的“罪魁禍首”之一)。然而,這樣的“單端”過濾,能夠去除如游離接頭等小片段,滿足大部分應用場景,但受片段化方式影響較大,偶爾會出現數據產出不均一的情況。因此,在起始樣本較多的前提下(Input DNA ≥ 200 ng),推薦“雙端”過濾,即“片段雙選”。其不僅可去除如游離接頭等小片段;還可去除大部分>700 bp(取決于片段長度)的文庫分子,使文庫分子片段分布更集中(圖3)。


根據經驗,針對Illumina??測序平臺我們建議篩選出350 bp~450 bp文庫片段進入靶向捕獲測序。


圖3.?片段單選與片段雙選結果示例,

NanoPrepTM建庫體系中,用于片段篩選的NanoPrepTM?SP Beads是一款高性價比的磁珠產品。與AMPure XP Beads的對比平行測試表明,其損耗小、片段篩選能力穩定(圖4)。



圖4.? NanoPrep SP Beads可回收> 50 bp的DNA。

在進行4雜和10雜外顯子捕獲過程中,在建庫過程中使用NanoPrepTM?SP Beads進行“片段雙選”。文庫混雜時,進行500 ng/文庫等量混合,同時混合捕獲4個與10個文庫樣本,其下機拆分后的數據產出均勻穩定(圖5)。


圖5. 在外顯子混合雜交捕獲中,采取“片段雙選”模式進行片段篩選,測序數據產出均一。

本實驗中樣本為片段化外周血gDNA 300 ng,利用NanoPrep DNA文庫構建體系進行建庫,后采取xGen Exome Research Panel進行外顯子靶向測序,HiSeqX PE150測序模式。

PCR擴增:別太多,夠用就行

片段篩選完成后,需要進行PCR擴增。考慮到PCR擴增存在偏好性,HiFi聚合酶的使用已是行業標配。


除了HiFi 聚合酶的使用,我們建議根據樣本類型、片段化Input DNA和文庫預期確定PCR循環數。在此步驟切忌文庫過度擴增,用于WES的DNA文庫可以通過循環數來控制文庫產出至600~1000 ng的總量,隨后單個文庫取500 ng進入雜交體系。


外顯子捕獲測序重要的評價指標重復率(Duplication rate)和擴增數有著直接關系。擴增數越多,因擴增產生的完全一致的文庫分子越多,測序數據重復率也相應增加,則有效的測序數據量被削減。以NanoPrepTM建庫體系為例,我們給出了相應的參考循環數(表4)。


表4. PCR擴增循環數參考



NanoPrepTM DNA文庫構建試劑盒

NanoPrepTM?DNA文庫構建試劑盒是基于A-T連接原理,針對Illumina?高通量測序平臺的文庫構建試劑盒。該試劑盒操作流程簡單,可用于全基因組測序,也可兼容靶向捕獲測序。該試劑盒包含以下3個建庫相關模塊,其高效穩定的文庫產出將助你WES捕獲測序“一臂之力”。



圖6. NanoPrepTM DNA文庫構建試劑盒建庫體系


如圖7所示,在相同的起始量和實驗條件下,NanoPrepTM?DNA文庫構建試劑盒的整體表現與Vendor K相當。對于10 ng、100 ng和1000 ng的Input DNA,通過調整循環數,NanoPrepTM?產出~1000 ng的文庫進入下游WES捕獲測序分析



圖7. 不同起始量下NanoPrepTM DNA文庫構建試劑盒的文庫產量。

以上便是我們以NanoPrepTM文庫試劑盒為例針對全外顯子捕獲實驗的相關建議。在《全外顯子捕獲那些事兒(下篇)》中,我們將結合最新捕獲實驗Protocol為大家梳理捕獲步驟的相關注意事項,盡請期待。


參考文獻

[1]https://international.neb.com/products/m6630-nebnext-ffpe-dna-repair-mix#Product%20Information


[2]http://sfvideo.blob.core.windows.net/sitefinity/docs/default-source/application-note/xgen-dual-index-umi-adapters-resolve-index-hopping-and-enable-low-frequency-variant-detection.pdf?sfvrsn=22bf0b07_4


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