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全外顯子捕獲那些事兒(下篇)

《全外顯子捕獲那些事兒(上篇)》我們整理了外顯子捕獲前期建庫過程中注意事項,本文將重點梳理捕獲部分的注意事項。

*本文相關操作說明以IDT的xGen?? Exome Research Panel 靶向捕獲為例;涉及到的WES相關數據都是利用IDT的xGen?? Exome Research Panel進行全外顯子捕獲?

文庫的質量首先你得有個靠譜的文庫

通過對市面上主流建庫試劑盒的對比,我們推薦使用NanoPrepTM系列,Illumina TruSeq系列等產品,以期獲得”靠譜的文庫“

? ? 外顯子捕獲表現穩定

“NanoPrepTM建庫+IDT xGen?? Exome Research Panel捕獲”的全外顯子測序(Whole Exome Sequencing,WES)方案中,表現出高度穩定的可重復性。如圖1所示,同一個樣本進行兩次WES,結果高度一致(Pearson R=0.97)。


? ? 圖1. NanoPrep文庫外顯子捕獲的批間重復

? ? ?捕獲覆蓋均一性好

? ? 與建庫表現評價相似,捕獲覆蓋均一性也是重要的考量指標。覆蓋均一性越好,后續才能用更少的測序數據量實現對目標區域的有效覆蓋,其前提是均一覆蓋的文庫。

? ? 如圖2所示,對比了NanoPrepTM和Vendor K文庫進行WES的覆蓋均一性.


? 圖2.? NanoPrep與Vendor K文庫進行外顯子捕獲覆蓋均一性。

可以通過不同GC含量探針對目標區域覆蓋的變異系數(Coefficiency of variation,CV)來評估覆蓋均一性。CV值越小說明均一性越好。利用NanoPrepTM構建的文庫(CV=0.58) 相比Vendor K(CV=0.62)在外顯子捕獲中覆蓋均一性更佳。

?文庫的混雜: 混得好才是真的好

文庫的混雜是指多個樣本文庫混合進入單次捕獲實驗。相較于單個文庫捕獲,混雜后捕獲可有效提高生產速度、顯著節約成本。然而多文庫混雜的方法勢必要進行優化,以期獲得與前者接近的中靶率和數據產出。

測序數據重復率

? ?混雜比計算方法如下所示,其本質為進入捕獲步驟的文庫豐度。混雜比越高則文庫豐度越高,相應的測序數據的重復率(Duplication rate)也較低,從而提升測序的有效數據量。


那一般來講,每個文庫投入多少進入混合捕獲呢?混雜比達到多少比較合適呢? 我們通過IDT的相關測試和NanoPrepTM的實戰經驗來闡述這個問題

IDT以下兩種方法進行不同水平的文庫混雜:

方法一對混合文庫取500 ng總量,平均分攤到每個文庫;

方法二每個文庫均取500 ng。

調整單個文庫實際建庫產出為500 ng,則混雜比計算如表1:

表1.?兩種文庫混雜方法



結果表明,方法一,重復率隨混雜比降低而明顯升高(圖3,?橙色);? 方法二,混雜的文庫數量不同但高混雜比(100%)時,重復率無明顯差異(圖3,?藍色)。方法一進行16-plex時,混雜比為6.25%,平均重復率為13.5%,與1-plex(混雜比為100%)相比,重復率擴大了近5倍。


圖3. 不同混雜方法下每個文庫的重復率。樣本:gDNA樣本;文庫構建:相同建庫流程;雜交捕獲:xGen AML Panel;測序:Illumina NextSeq;數據分析:單個文庫在相同測序量下,使用Picard’s HsMetrics進行生信分析[1]。


此處的測序平臺為Illumina NextSeq??。而現有WES常見模式為多樣本混合后“湊lane”在HiSeq-X??或NovaSeq??這類高通量測序平臺進行混合測序。這些平臺的天然重復率偏高(詳見《二代測序中Duplication Rate雜談》)。因此,我們進一步分析了HiSeq-X平臺上的混雜WES測試結果。


利用NanoPrepTM構建的12個或16個文庫混合進行單次捕獲實驗,即常說的“12雜(12-plex)”與“16雜(16-plex)”。混雜的原則,遵循我們在前篇提到的:“推薦用于WES的DNA文庫通過循環數控制產出在600~1,000 ng之間。取~500 ng用于捕獲,確保混雜比達到50%或以上。”(詳見《全外顯子捕獲那些事兒(上篇)》)


NanoPrepTM文庫12-plex(6μg總量)和16-plex(8μg總量)進行WES的結果如圖4所示。結果顯示12-plex和16-plex平均中靶率(Flanked On target%)分別高達92.18%和86.20%,重復率分別為7.36% 和7.66%。


圖4.?NanoPrep文庫在12-plex和16-plex下外顯子捕獲表現(A)不同混雜水平下外顯子捕獲中靶率與重復率;(B) 不同混雜水平下覆蓋較為均一。以上測試,樣本均為外周血來源的gDNA樣本,采取Illumina HiSeq-X PE150進行測序,每個文庫選取 35M reads 數據,利用BWA工具比對到GRCh37/hg19參考基因組,按照Reads計算中靶率


以上表現數據與我們常見的單雜無本質差別,因此證實多樣本捕獲切實可行。然而值得注意的是,16-plex時中靶率略有下降,這是因為>6 μg的總文庫量在捕獲探針與目標分子比率上已非最佳動力學狀態,中靶率因此受到影響。

靈活調整混雜比例

進行混合捕獲時,若每個文庫期望測序數據產出一致,我們推薦每個文庫500 ng進行等量混合;若根據不同的檢測目的,期望不同的數據量產出,可以根據所需數據比例混雜,如表2 所示。另外,當文庫總量限制時,也可根據實際情況進行調整。

表2. 根據期望數據產出比例混雜文庫示例



關于混雜比的詳細信息,可以查看《二代測序中Duplication rate 雜談(二)》。

封閉非特異序列: 提升捕獲效率的重要助力

在進行人類全外顯子捕獲中,我們強烈建議大家根據文庫類型使用封閉文庫接頭的封阻序列(xGen?? Universal Blocker-TS Mix)和封閉基因組重復序列的Human Cot -1 DNA(包含在 xGen?? Hybridization and Wash Kit中)。以上兩個組分可以降低接頭間和重復序列間的非特異性結合,進而降低脫靶率,從而提升有效捕獲數據比例(圖5)。



圖5. (A)基因組中的重復區域和文庫接頭通用序列易引入脫靶分子(B)Illumina TruSeq文庫使用xGen AML Panel進行捕獲時,對常見的多種index序列接頭,均可被xGen Universal Blocker-TS Mix高效封閉,顯著提高中靶率。

如果您使用的建庫方法為快速建庫的Illumina Nextera系列,建議配套使用IDT xGen?? Universal Blocker-NXT Mix封阻序列

? ? 精準控溫:高效捕獲的關鍵一步

在NGS雜交洗脫操作中即使溫度發生了輕微改變,如±2 ℃,都可能會對Flanking區域的中靶率以及GC偏好性(GC bias)產生影響。

NGS數據中GC bias被認為是衡量捕獲均一性的重要指標之一,所以校準實驗儀器的溫度是必須要考慮的因素。略高的洗脫溫度,會導致對GC區域捕獲的損失;略低的洗脫溫度,會導致非特異性捕獲增加,中靶率下降。

例如,在國內南方冬天時候,室內的溫度有時偏低,偶爾會出現捕獲后文庫產量超出經驗值,測序結果中靶率顯著降低的情況。這種情況,一般都是因為熱洗脫步驟溫度偏低造成的。 嚴格控制雜交洗脫溫度非常重要,尤其是在“熱洗脫”步驟。我們建議洗脫操作要迅速,并且使用前至少65℃預熱15 min 熱洗脫Buffer。

?M-270磁珠操作:“抓娃娃”多面手

鏈霉親和素磁珠(Dynabeads?? M-270 Streptavidin Beads, M-270,包含在 xGen?? Hybridization and Wash Kit中)用于與探針5'端生物素修飾結合,在磁力架的作用下富集并洗脫靶向區域DNA。在實驗操作中需要注意以下幾點:

1.避免在任何時候讓M-270過于干燥。如果必要,可以輕微延長洗脫時間,防止M-270過干。

2.磁珠捕獲時,在雜交文庫與M-270磁珠65℃孵育45 min期間,每10-12 min混勻一次,會增加磁珠與靶向目標文庫分子探針的結合,提升捕獲表現。

3.室溫洗脫步驟時,需要確保M-270磁珠充分重懸,充分重懸能夠提高最終外顯子捕獲數據質量。推薦大家遵循說明書進行操作:室溫孵育期間充分渦旋混勻,渦旋過程中少量磁珠飛濺在密封蓋上并不會對捕獲結果產生影響。

捕獲后PCR:適可而止

與建庫步驟中相似,WES捕獲后擴增,我們建議依據雜交時間、混雜數目選擇相應的擴增循環數,避免過度擴增。IDT的WES捕獲實驗支持快速雜交(4h)和過夜雜交(16h)。

表3. NanoPrep建庫體系推薦的WES捕獲后擴增循環數



以上,就是我們針對外顯子捕獲的相關建議,有任何技術問題,歡迎聯系納昂達技術支持[email protected]

覆蓋~20,000個基因CDS區域的WES用途甚廣。近期業內大號也出了不少綜述文章。與此同時,WESPlus 層出不窮,其本質是以核心外顯子為基礎補充其他疾病相關位點。《全外顯子捕獲那些事兒》上篇和下篇中提及的操作手段和相關建議均適用。如有任何技術問題,歡迎公眾號留言。

NanoPrepTM DNA文庫構建系列


參考文獻

[1]Picard’s HsMetrics, https://broadinstitute.github.io/picard/picard-metric-definitions.html [Accessed 8 Mar, 2018].


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