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【新品上市】給你的接頭披上“金鐘罩”

DNA甲基化作為一種表觀調控機制,可以調節基因的表達。生長發育、疾病、環境、壓力等因素均會影響DNA甲基化修飾模式(Methylation pattern)。Methylation pattern的改變在細胞分化等正常生長發育過程中是必須的,但是在“無限分裂”的癌細胞中會出現異常[1]。近年來多篇研究文獻表明,DNA甲基化可以作為標志物應用于癌癥早診早篩,越來越多的研究人員利用更高通量的NGS對其進行深入研究[2]。亞硫酸氫鹽轉化(Bisulfite conversion)以其可達到單堿基的分辨率成為甲基化研究的“金標準”[1]


圖1. DNA甲基化[3](A)DNA甲基化發生在胞嘧啶的第五個碳原子;(B)DNA甲基化多發生在CpG處,也可以發生在非CpG中。

如圖2所示,BS通過亞硫酸氫鹽介導未甲基化的胞嘧啶(C)脫氨基轉化為尿嘧啶(U),甲基化的C維持不變。這個過程將“修飾信息”轉化為“堿基信息”,后續通過測序即可對甲基化修飾信號進行檢測。


圖2. 亞硫酸氫鹽轉化過程[4]。

全基因組甲基化測序(Whole genome bisulfite sequencing, WGBS)和甲基化捕獲技術(Methly Capture Sequencing)是基于Bisulfite conversion的兩種常用的甲基化檢測方案,均需進行文庫構建。表1列出了三種建庫的流程。

表1. 甲基化建庫實驗流程



對于建庫步驟,根據亞硫酸氫鹽轉化(Bisulfite conversion)的先后分兩大類——“接頭優先”與“轉化優先”。在起始量充足的情況下,差異不大,但是在有限的起始量情況下,“轉化優先”的單鏈連接法PCR-duplicate受影響較小[5]

以上3種建庫方法中, Pre-bisulfite conversion方法使用時間最久,建庫的連接模塊通用于市場上基于A-T連接原理的試劑盒。Bisulfite conversion過程中,會遭遇高溫、高鹽等嚴苛的條件,會出現單雙鏈混合、斷裂等損傷,造成原始DNA分子的減少。目前市場上一些商品化的Bisulfite conversion試劑盒用溫度變性替代了之前的化學變性,盡可能的在轉化率和DNA降解度尋找一個平衡[6]。Pre-bisulfite conversion建庫方法仍有廣泛的應用。

Pre-bisulfite conversion建庫的接頭模塊與普通建庫不同,接頭必須披上“金鐘罩”,即所有的C均需要修飾為Methyl dC,幫助接頭安然無恙的度過Bisulfite conversion的“折磨”,直至上機測序。

以帶有8nt UDI的接頭為例,一個Y型的接頭共有40余個C,占整體堿基數的約30% 。一個Methyl dC的價格是普通C的50倍以上,小規格定制甲基化接頭成本較大。因此,納昂達向以“接頭優先”方式建庫的客戶提供商品化的甲基化接頭(表2)。


表2. 甲基化接頭產品信息


與納昂達目前在售的其他接頭一致,Methylated 8nt UDI Adapters同樣均含有UDI 樣本標簽,幫助剔除全流程產生的樣本標簽錯配。詳情可參考《接頭暗語》。

甲基化捕獲結合了甲基化芯片和WGBS的優勢,可針對感興趣的目標區域進行甲基化分析,節約了經濟和時間成本,可同時對多個樣本進行分析,并可達單堿基分辨率。

同樣的,甲基化捕獲根據Bisulfite conversion過程的先后,也主要有以下三種方案:


圖3. 甲基化捕獲方案[5]。(改編自Swift 官網)

納昂達甲基化接頭,可以滿足上述方案1 和方案2的建庫流程。對于捕獲探針設計方面,方案1目標片段為原始DNA,IDT可以為客戶在線提供針對hg19參考基因組的IDT探針設計。甲基化通常存在于CpG島等高GC區域,獨立合成,獨立質檢的IDT探針在GC-rich區域的一直以來也有優秀表現(圖4)。


圖4. IDT xGen Exome Research Panel 在GC偏好性更小。不同品牌全外顯子測序數據與全基因組測序數據對比,IDT對GC-rich區域有較好對覆蓋。

針對方案2和3,先轉化后捕獲的操作流程,我們也可以協助客戶進行探針設計。值得一提的是,IDT獨立合成,獨立質檢120 mer生物素修飾探針,可以容納7 bp堿基錯配,7 bp以內的堿基錯配導致的Tm值波動<5℃(圖5)。這種小幅度的Tm值變化不會影響捕獲效率。這種特性,使得IDT探針可以天然容納多個位點的甲基化變化。


圖5. 120 mer 探針中不同個數的錯配對Tm值的影響。

先轉化后捕獲的探針設計方案略有復雜,感興趣的老師可以聯系納昂達技術支持 [email protected],400 8717 699。


基于Bisulfite conversion結合NGS的分析方法盡管仍存在降低基因組復雜度、損傷DNA、具有轉化偏好性等問題,但是仍為甲基化標志物在癌癥早篩早診研究中的重要方法之一。納昂達會繼續用多樣的產品和方案幫助研究者在甲基化研究領域向前推進


參考文獻

[1] Lvanoov, M,; Kals,M, et al. In-solution hybrid capture ofbisulfite-converted DNA for targeted bisulfite sequencing of 174 ADME genes. Nucleic Acids Research 2013

[2] Xu, RH,; Wei,W, et al. Circulating tumour DNA methylationmarkers for diagnosis and prognosis of hepatocellular carcinoma. Nature Materials 2017

[3] Jang,HS,; Shin WJ, et al. CpG and Non-CpG Methylation in epigenetic gene regulation and brain function. Gene 2017

[4] https://www.diagenode.com/en/applications/dna-bisulfite-conversion

[5 https://swiftbiosci.com/products/accel-ngs-methyl-seq-dna-library-kit/


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