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上新 | 高編輯效率Alt-R A.s. Cas12a(Cpf1) Ultra

5月30日,Integrated DNA Technologies正式上線其開發的CRISPR基因編輯新工具Alt-R A.s. Cas12a (Cpf1) Ultra 蛋白,幾個月前IDT已經對其在人類基因治療應用方向,與Editas Medicine 簽訂了獨家授權協議。



Editas Medicine, Inc.(納斯達克股票代碼EDIT)是最早IPO的CRISPR公司,其由張峰和Jennifer Doundna等人于2016年9月聯合創辦。

2016年Editas取得了the Broad Institute等機構的針對多種CRISPR酶在人類基因治療應用方向獨家授權。2018年底FDA批準該公司開展利用CRISPR編輯手段治療Leber先天性黑內障10(LCA10)






CRISPR-Cas12a首次發表于2015年,引導RNA(guide RNA, gRNA) 識別TTTV(V=A/G/C) PAM位點,作為CRISPR-Cas9(PAM位點為NGG) 的補充,擴展了CRISPR系統可編輯的位點1


上圖為Cas12a 酶與Cas12a crRNA結合形成Ribonucleoprotein complex(RNP)。 crRNA包含兩部分,20 base通用的環裝結構域(深綠色)和20-24 base的目標特異Protospacer元件(藍色)構成。


盡管研究表明野生型A.s. Cas12a在人類基因組編輯活性低于野生型S.p Cas9(圖1),但是該系統gRNA較短(40-44 nt),具有較高的編輯特異性,適用于AT-rich基因組等特點,使其仍為CRISPR工具箱里的利器之一。


圖1. 野生型CRISPR-Ca9和CRISPR-Cas12a (Cpf1)以電轉RNP的方式對HEK293細胞系STAT3基因Exon5 &6基因編輯效率對比。


A.s. Cas12a Ultra優異表現


為了滿足基因組學研究的前沿需求,針對野生型Cas12a酶基因編輯效率低,對TTTT PAM位點不敏感等局限,IDT對多種Cas12a突變體進行了篩選及改造,新推出Alt-R A.s. Cas12a Ultra蛋白,Acidaminococcus sp. BV3L6 Cas12a (Cpf1)突變體,具有以下幾個特點:


  • 整體提高Cas12a系統在人類細胞的編輯效率,可媲美Cas9的切割活性

  • 使Cas12a系統對PAM位點為TTTT的目標區域編輯成為可能

  • 室溫下具有活性,更廣泛的溫度適用范圍可以應用于植物等其他生物編輯



圖2. Alt-R A.s. Cas12a(Cpf1) Ultra 整體提高基因編輯效率。野生型和Cas12a Ultra與靶向Jurkat細胞系120個位點及靶向HEK-293 細胞系96 個位點crRNA組裝形成多種RNP。在Alt-R Cas12a電轉增強劑的輔助下將 RNP(4μM)轉入目標細胞系中。利用二代測序方法進行基因編輯效率分析。



圖3. Alt-R A.s. Cas12a Ultra以RNP的形式在HEK293細胞系 CTNNB1 基因多個PAM序列為TTTT的目標位點啟動基因編輯。


優化的CRISPR-Cas12a系統


CRISPR Cas12a系統可以RNP的形式,也可以“Cas12a蛋白穩轉細胞系+ crRNA”的形式發揮作用。基于簡化實驗方面(圖5)和降低脫靶率(圖4)等方面考慮,IDT建議首選電轉 Cas12a 的 RNP 復合體的方式。



圖4. CRISPR-Cas12a RNP形式比質粒形式脫靶率更低。

 

IDT Alt-R CRISPR-Cas12a體系使用簡單,1小時左右即可完成實驗操作。實驗僅需兩步:

 


圖5. IDT Alt-R CRISPR-Cas12a工作流程。

 

除了提供優化的Cas12a蛋白,IDT還提供專利修飾的Alt-R Cas12a crRNA,修飾可保護crRNA不被細胞內RNases降解,進一步提高編輯效率。

 

IDT研究表明,crRNA的長度優化可以提升對哺乳動物基因編輯的表現。整體來說, 21mer Protospacer元件的crRNA在絕大多數目標位點,具有最佳的編輯效率。(圖6)




圖6. 不同長度crRNA的基因編輯表現。針對 HPRT 基因設計不同長度的 crRNA 用 Lipofectamine? RNAiMAX TM 試劑 (Thermo Fisher) 將 crRNA 轉染至穩定表達A.s. Cas12a 的 HEK-293-Cas12a 細胞系中。隨后用基于T7EI核酸內切酶錯配切割原理的Alt-R Genome Editing Detection Kit進行基因編輯效率檢測。


電轉好伙伴—電轉增強劑


不同于CRISPR-Cas9系統,Cas12a RNP復合體較難利用脂質體轉染。IDT推薦搭配使用電轉增強劑—Alt-R Cas12a Electroporation Enhancer進行電轉RNP。


該電轉增強劑是Cas12a系統的專用單鏈carrier DNA,設計時特異避免在人、大鼠、小鼠基因組的同源型,輔助RNP在培養細胞中的高效電轉,從而提高系統的編輯效率。

 

如圖7所示,該產品可以提高在RNP復合體在小鼠Hepa1-6細胞系和人HEK-293細胞系靶向HPRT基因多個位點編輯效率2



圖7. Cas12a電轉增強劑產品表現。48小時后提取基因組DNA,并PCR擴增目的片段,隨后用基于T7EI核酸內切酶錯配切割原理的Alt-R Genome Editing Detection Kit進行基因編輯效率檢測。

以上就是我們對CRISPR-Cas12a系統的一個簡要介紹,后續我們將會給大家帶來更多的關于IDT Alt-R CRISPR系列產品的表現與應用。

 

IDT領先的蛋白重組和合成,以及世界一流的技術支持,都將使IDT Alt-R CRISPR系列產品成為服務廣大研究者觸手可及的“百寶箱”。

 

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參考文獻

1.Zetsche B, Gootenberg JS, et al. (2015) Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system. Cell, 163(3):759–771.

2.https://sg.idtdna.com/pages/education/decoded/article/crispr-cpf1-an-alternative-to-cas9-for-targeting-at-rich-genomes



產品介紹



Cas12a(Cpf1)Nuclease



CRISPR-Cas12a(Cpf1) crRNA



Cas12a Electroporation Enhancer


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