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CRISPR專區

您要佩奇DNA & RNA?

IDT作為DNA合成領域的“領頭羊”,一直致力為客戶一站式佩(配)奇(齊)多種生物學應用所需核酸序列,專治各種DNA & RNA合成的“疑難雜癥”。

這篇文章,我們小結下日常被咨詢最多的關于核酸序列合成的典型問題。

問題 1:你們能合成 ___ bases長度的DNA/ RNA嗎?

這種情況一般都是來咨詢長鏈DNA/RNA合成。IDT提供具有行業領先耦合效率Ultramer?? DNA和Ultramer?? RNA產品,可以直接合成長達200 base 單鏈DNA和120 bases 單鏈RNA。通過克隆純化的方法,還可合成長達2,000 bases的長單鏈DNA。另外,IDT也可合成從長達數kb的雙鏈DNA。

耦合效率為平均每個堿基被準確合成的效率,Ultramer??技術的優勢在合成長序列時尤為明顯(圖1)。以200 bases DNA Oligo為例,在耦合效率為98.5%的工業標準下,全長產物比例僅為5%,遠遠低于Ultramer??技術下38%的全長終產物。Ultramer技術可幫研究人員獲得更長,更純的單鏈核酸。


圖1. Ultramer技術的耦合效率(A)Ultramer DNA;(B)Ultramer RNA。

小應用

在CRISPR介導的基因編輯的同源重組(Homology directed repair, HDR)應用中,長單鏈DNA常被用來做HDR模板。詳情可以參考下面文章。

《一個神操作!提升CRISPR介導HDR效率數倍》

《CRISPR-Cas9介導同源重組指南概要》

問題 2:你們能合成___修飾嗎?

IDT可以合成帶有修飾的序列,修飾序列可以游刃有余的在克隆、多種雜交、酶聯免疫反應、基因編輯等多種生物學應用中大顯身手。

常見修飾分類


每種修飾的功能不一而足,本篇文章我們管中窺豹,以核酸酶抗性功能為例簡介一些修飾。后續我們將給大家帶來更多關于修飾的知識點。

在RNAi,CRISPR基因編輯等應用中,為了不出現DNA/RNA“出師未捷身先死”的狀況,核酸酶抗性修飾就顯得尤為重要。


硫代修飾

即為硫代磷酸酯鍵(Phosphorothioate bonds, PS bonds),硫原子替代在序列磷酸鹽骨架中非橋接的氧,增強核苷酸之間的連接,使其核酸酶的抗性更強。

IDT建議序列兩端可添加硫代修飾以阻止核酸外切酶的分解。若全序列“裝備”硫代修飾,整個序列便可抵抗核酸酶的攻擊,但是核酸的細胞毒性也相應增加,需酌情選取。


磷酸化

3’磷酸化修飾可以阻止3’核酸外切酶對序列的降解。此外,還有常見的5’磷酸化,可用于接頭、克隆、基因構建及一些連接酶催化的連接反應。


C3 Spacer

C3 Spacer是常用間臂修飾的一種。該修飾在3’端可以阻止核酸外切酶發生功能,也被用來阻擋引物延伸。

此外,如果想減少熒光染料、生物素等修飾與核酸的相互作用,也可以選取多個C3 Spacer修飾作為親水的間隔。

修飾堿基

除了上述修飾外,一些經過特殊修飾的堿基也可以起到阻止核酸降解的作用,如甲氧基修飾堿基、氟代堿基、反向脫氧胸腺嘧啶。

小應用

IDT提供經過優化的Alt-R? CRISPR-Cas9基因編輯系統工具,包含如下3種形式的引導RNA(guide RNA, gRNA)。


這三種gRNA均經過IDT專利的化學修飾,來保護gRNA不被細胞內RNases降解,提高編輯表現。尤其是crRNA XT:tracrRNA和sgRNA,推薦使用在高核酸酶環境

另有研究表明,CRISPR介導的HDR中,若模板ssDNA 5’和3’端添加硫代修飾,將提高細胞內的核酸酶抗性,HDR效率相應提高[1]。

除以上舉例的修飾基團外,IDT還提供除以上修飾外更多的修飾。經常被咨詢的有氨基修飾,生物素修飾,巰基修飾,多種熒光基團與淬滅基團等。

更多修飾,可移步IDT官網,我們后續也會為大家帶來更詳盡的說明。

https://sg.idtdna.com/pages/products/custom-dna-rna/oligo-modifications

問題 3:引物、探針序列里含有連續的G和T,實驗表現不好怎么辦?

如果遇到了這種情況,可以嘗試使用IDT專利修飾的Super G?? 和Super T?? 堿基。兩者均可被DNA聚合酶正常的延伸。

Super G?? 可減少因多個G堿基存在易形成的non-Watson-Crick二級結構,并且和G堿基不同,Super G?? 不會使相鄰熒光染料的亮度降低,可以提高qPCR探針的表現。Super T?? 可增加Tm值,穩定雙鏈,可以應用于AT-rich序列的引物或探針。

問題 4:我想訂購應用于二代測序的序列,你們有什么建議嗎?

二代測序中,文庫構建步驟的接頭與擴增引物,捕獲步驟的探針與封阻序列,本質來講都是修飾核酸序列。


文庫接頭

以Illumina平臺的Y型接頭為例,兩條DNA鏈,一條5’端磷酸修飾,一條3’端幾個堿基一般帶有硫代修飾,標記為TC*T或T*C*T。


圖2. Illumina平臺接頭序列信息及常用修飾。

正如問題1提到的,硫代修飾是為了防止末端的Overhanging T堿基在連接的過程中被體系中的核酸酶“誤傷”;5’磷酸修飾主要功能是A-T連接的過程中形成磷酸二酯鍵。納昂達提供多種商品化的接頭,詳情可以參考下文。

《NGS接頭暗語》

TruGrade

NGS高靈敏度檢驗中,必須嚴格控制NGS接頭和含Index擴增引物合成過程中的交叉污染。IDT專利 TruGrade?? DNA Oligo,將交叉污染降低至0.01%。關于接頭和TruGrade??合成更詳細的信息,可以參考下文,在此不多做贅述。

《正本清源—TruGrade Oligo護航你的高靈敏度檢驗》

甲基化接頭

除此以外,針對重亞硫酸鹽測序,IDT可提供定制的甲基化的接頭(Methylated adapters),即接頭中所有的C堿基被替換為修飾堿基5-Methyl dC,后續不受重亞硫酸氫鹽轉化的影響。

圖3. 甲基化修飾的胞嘧啶核苷酸結構。

納昂達作為專業的靶向整體解決方案的提供者,我們提供多種商品化和定制的NGS Oligo。更詳細的信息,歡迎留言或聯系[email protected]

問題 5:我想訂購大規格的序列,用于分子診斷試劑盒的生產,如何保證序列質量?

IDT有能力為多種應用合成大規模、高質量、多種包裝形式的核酸原料。分子診斷試劑盒的研發到生產,核酸原料的生產方式可以由適用于科研的RUO級別升級為GMP。


GMP

GMP生產設備經過ISO 13485:2016認證,符合美國FDA質量體系規則21 CFR Part820。可以追蹤訂購產品的生產流程,如果你選擇了IDT GMP級別的產品,將得到

每個訂單world-class LIMS* 記錄

每個產品的紙質版的質檢文件

長期質量協議保證GMP 產品的穩定供應

* LIMS:Laboratory information managment system

包裝

序列池、引物對、退火雙鏈DNA等多種服務及靈活的包裝方式。

質檢方式

除了每條序列生產時默認的電噴霧電離質譜(ESI-MS,圖4)質檢方法,IDT還可提供毛細管電泳(Capillary Electrophoresis,圖5),分析純級別的HPLC(Analytical HPLC)等質檢方法。

圖4. /56-FAM/-/ZEN/-/3IABkFQ/探針ESI-MS質檢示例。


圖5. HPLC純化的/56-FAM/-/ZEN/-/3IABkFQ/探針CE質檢示例。

IDT作為一個30多年的專注于核酸合成企業,基本能“佩奇”您各種需求的DNA & RNA。我們這篇文章只是簡述一二,后續還將繼續為大家整理DNA/RNA合成的知識點。

更詳細的產品信息,歡迎咨詢400 8717 699;[email protected]

參考文獻

[1]?J. B. Renaud et?al.,?Improved Genome Editing Efficiency and Flexibility Using Modified Oligonucleotides with TALEN and CRISPR-Cas9 Nucleases. Cell Rep 14, 2263-2272 (2016).


本文主要翻譯自IDT官網和相關產品信息。如需轉載請聯系公眾號后臺。

https://sg.idtdna.com/pages/education/decoded/article/modification-highlight-modifications-that-block-nuclease-degradation


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