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【5個小技巧】助您設計CRISPR介導HDR供體DNA

導語

優化實驗條件和設計供體DNA模板(Donor template)是獲得高同源重組修復率的關鍵。本文將為大家介紹介紹為什么單鏈供體模板(Single-stranded donor oligonucleotides, ssODN )在CRISPR介導的同源重組(Homology directed repair, HDR)表現更優,以及如何設計最佳的HDR模板。

CRISPR-Cas9通過使各種模式生物的基因組發生有效的位點特異性變化的方式來徹底改變基因組研究。在Cas9蛋白使DNA發生雙鏈斷裂(Double-strand break, DSB)后,哺乳動物細胞能利用內源性DNA修復機制將斷裂端連接在一起。細胞修復斷裂有兩種主要途徑:非同源末端連接(Non-homologous end joining, NHEJ)和HDR。



圖1. CRISPR介導的NHEJ和HDR。

顧名思義,NHEJ連接DSB端,不需要同源模板。然而,NHEJ活性容易出錯,在斷裂點處易引入插入或缺失,可能會使目標基因功能異常。因此,NHEJ對基因敲除非常有用。

為了引入精確的序列特異性變化需要另外一種修復途徑—HDR。HDR需要包含與斷裂點同源臂相同的供體DNA片段,以便通過內源性細胞機制實現HDR[1]。因此,HDR可以無錯誤地修復DSB,DNA模板可以在同源臂之間進行序列變化,或者在斷裂點附近插入更大的片段。

ssDNA供體模板的優點

過去,常用雙鏈DNAs(dsDNA)作為供體模板[2]。但是dsDNA容易被NHEJ修復途徑合并,從而導致同源臂的復制或者dsDNA模板的部分整合。通過NHEJ同源獨立性插入片段也可能會發生DSB脫靶或者產生內源性DSBs。

圖2. 以ssODN和dsDNA模版介導HDR產物結果。

dsDNA為HDR模版會存在一部分NHEJ產物。

另外,dsDNAs對培養細胞是有害的,線型或者質粒dsDNAs的轉染效率較低和使細胞產生不良反應[3,4]。為了避免此類結果,研究人員把注意力轉到了ssODN 。ssODNs長期在細菌和低等真核細胞里顯示出良好的重組效率[5]。相比于dsDNA模板ssDNAs同源臂更短,插入效率更高[6,7]。因此,ssODN將成為HDR的首選模板。

作為全球DNA合成的領頭羊,IDT現在提供Megamer Single-Stranded DNA片段合成服務。這些長而高保真的序列非常適合CRISPR HDR實驗。Megamer Single-Stranded DNA片段是經NGS驗證的長度為200到2000堿基的ssDNA。這些較長的片段支持復雜的位點特異性編輯,例如在老鼠體內產生或插入等位基因[8]

模板設計的注意事項


優化實驗條件和設計Megamer供體模板是獲得HDR高效率的關鍵。斷點位置、同源臂的長度、SNPs或其他序列變異、可能的二級結構和GC含量都是重要的考慮因素。

確保Cas9酶切點接近于靶點位置

Cas9酶切點與靶點的距離會影響HDR的效率。IDT用短鏈ssDNA模板研究這種距離對HEK-293細胞的影響。研究發現,當模板插入點與酶切點相距5-10 nt時,HDR效率明顯降低。所以建議使酶切位點盡可能的接近插入位點。如果插入位點固定,就限制了操作的選擇。這種情況下,建議比起最佳間隔距離,優先考慮操作的選擇性。

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圖3. HDR donor template 設計示例。引入2 nt堿基替換。

?使用75-100堿基同源臂

供體模板中的同源臂對應于基因組切割位點兩側的序列。同源臂的長度會影響HDR的效率。對于短鏈ssDNA模板,30-40個堿基同源臂就能產生穩定的HDR. 但是根據我們的研究發現,針對長鏈ssDNA模板,我們建議設計75-100個堿基同源臂。這是因為不同的生物系統中可能存在HDR效率差異和核酸酶降解的情況。

避免同源臂覆蓋于SNPs或者其他序列變異位置

SNPs或者其他序列變異的存在會降低HDR的效率。我們建議驗證感興趣的細胞系(或模式生物)的序列。因為在參考基因組中可能存在沒有特征或注釋的序列變異。

避免形成二級結構和高GC含量

在設計Megamer過程中,可能會存在非預期的二級結構或者高GC含量的區域。

具體來說,模板的末端區域(通常是同源臂)對GC含量特別敏感。根據IDT幾十年DNA合成經驗對寡核苷酸二級結構的理解,我們建議將Megamer片段兩端的50個堿基的GC含量限制在28%-72%以內,以避免二級結構。如果同源臂的GC含量不在此范圍內,我們建議移動或延長同源臂。IDT在線Megamer審查工具將對訂購序列的GC含量進行審查。

針對含有loxP位點的Megamer片段的設計建議

Cre-loxP系統是細胞內一個強大的多功能的DNA重組系統(圖4)。這個系統是由Cre重組酶和34bp識別序列(loxP位點)組成。loxP的位置和方位決定了側翼序列的重新排列[8]

圖4. Cre-loxP系統示例[9]。(a)loxP序列由2個13bp的回文序列組成,中間被一個8 bp 非對稱核心間隔單元分開;(b,c,d)Cre-loxP可以通過重組引入倒位,刪除,易位等變異。

一些loxP位點變體在間隔區或者重復序列區中有突變。使用這些非標準的loxP位點可減少重組產物再切除,進而實現更有效的整合。

因長重復區域的存在可能導致非預期重組,所以生產包含兩個相同loxP位點的序列會是一個挑戰。嵌合在IDT訂購系統里的工具能在下單前自動識別提交的Megamer序列,并自動放棄2個loxP位點太靠近的設計。如果模板需要串聯loxP位點,我們建議構建一個長度至少為800堿基的Megmer片段,并將2個loxP位點至少間隔500個堿基。或者,你可以使用非標準loxP位點來降低合成序列的復雜性[10]

www.idtdna.com/site/order/megamerentry 使用IDT自動化工具去測試序列的復雜性和識別任何問題區域(圖5)。


圖5. IDT提供在線Megamer的審查工具。

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Megamer Single-Stranded DNA

IDT 使用最新和最精準的制造工藝合成Megamer片段,從而達到接近克隆的精度和純度。我們對每個Megamer 片段進行二代測序驗證和單鏈毛細管電泳來確保交付的產品是精確可靠的。

IDT率先使用NGS的方法來確認Megamer序列,因為它比Sanger測序有明顯的優勢,并且能檢測出傳統QC檢測不到的亞群。Megamer Single-Stranded DNA片段通常是下訂單后2-4周發貨。

Megamer 產品詳情


全文翻譯自IDT官網 Megamer single-stranded donor templates(ssDNA or ssODNs) for successful homology-directed repair(HDR) in genome editing applications,原作者為Brian Wang和Bahri Kara?ay。如需轉載,請聯系公眾號后臺。


? 參考文獻

[1]?LiD, Qiu Z, et al. (2013) Heritable gene targeting in the mouse and rat using aCRISPR-Cas system. Nat Biotechnol, 31(8):681–683.

[2]Shao Y, Guan Y, et al. (2014)CRISPR/Cas-mediated genome editing in the rat via direct injection of one-cellembryos. Nat Protoc, 9(10):2493–2512.

[3]Roth T, Puig-Saus C, et al. (2018)Reprogramming human T cell function and specificity with non-viral genometargeting. Nature, 559(7714):405–409.

[4]Hornung V & Latz E (2010)Intracellular DNA recognition. Nat Rev Immunol, 10:123–130.

[5]Simon JR, Moore PD (1987)Homologous recombination between single-stranded DNA and chromosomal genes insaccharomyces cerevisiae. Mol Cell Biol, 7(7):2329–2334.

[6]Miura H, Gurumurthy CB, et al.(2015) Crispr/cas9-based generation of knockdown mice by intronic insertion ofartificial microrna using longer single-stranded DNA. Sci Rep, 5:12799.

[7]Yoshimi K, Kunihiro Y, et al. (2016)ssODN-mediated knock-in with CRISPR-Cas for large genomic regions in zygotes.Nat Commun, 7:10431.

[8]Quadros RM, Miura H, et al. (2017)easi-CRISPR: a robust method for one-step generation of mice?carryingconditional and insertion alleles using long ssDNA donors and CRISPRribonucleoproteins. Genome Bio, 18:92.

[9]https://www.researchgate.net/figure/Cre-lox-system-A-The-34-base-pair-loxP-sequence-consists-of-an-8-base-pair-core_fig2_283787920

[10]Araki K, Araki M, et al. (2002)Site-directed integration of the cre gene mediated by cre recombinase using acombination of mutant lox sites. Nucleic Acids Res, 30(19):e103.


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